通常将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中蛋白 质的含量或酶的活力，并与100％破碎所获得的标准数值 比较；

  添加细小的珠粒，玻璃或者钢制的，不仅对空穴的形 成有帮助，而且产生辅助 “研磨”效应，来提升破 碎效率。

  在连续操作中，流速取决于细胞在反应器中的停留 时间，并影响破碎的总收率。 声波破碎在实验室大范围的应用，但在工业范围中还未 采用这种方法，因为要向大量细胞悬浮液中通入足 够的能量是很困难的。

  1、 了解微生物细胞破碎的方法。 2、 掌握研磨法、超声波、酶解法破碎细

  细胞破碎是为了破坏细胞外围使细胞内含物释放开来。 微生物的细胞外围通常包括细胞壁和细胞膜，它们起着支 撑细胞的作用。细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，由于 不同微生物细胞壁的结构的不同，所采用的细胞破碎方法 和条件也不一样。 细胞破碎的方法很多，归纳起来可分为机械破碎法、物理 破碎法、化学破碎法和酶学破碎法等。

  研磨：将细胞悬液与玻璃珠、石英砂或氧化铝一起快速 搅拌或研磨，使细胞破碎。

  实验室设备：Mickle高速组织捣碎机和Braun匀浆器， 利用玻璃小珠撞击微生物细胞而破碎。

  超声波破碎是应用较多的一种破碎方法。其特点是简便、快捷、 效果好，非常适合于微生物细胞的破碎。

  1．功率调整到最小值的位置。 2．设定：工作次数、超声时间（上班时间）、间隙

  3．打开开关，开机后电源指示灯亮。 4．保护复位；工作复位。 5．显示屏开始显示工作的设定数据。 6．调节功率至所需数值。 7．工作至总次数为零时候，仪器处于停振状态。如

  超声波破碎机通常在15-25 kHz的频率下操作，细胞是由于超 声波的空穴作用而破碎。空穴泡受到超声波的冲击而产生很强 的冲击波压力，引起粘滞性旋涡，在介质中悬浮细胞上造成了 剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。超声 波破碎的程度与输出功率和破碎时间有密切关系，同时受细胞 浓度、溶液粘度、pH值、温度以及离子强度等因素有关。

  优点: 产品释放的选择性高; 抽提的速率和收率高; 产品的破坏最少; 对pH值和温度等外界条件要求低; 不残留细胞碎片。

  溶酶价格高，通用性差（不同菌种需选不一样的酶）， 产物抑制的存ห้องสมุดไป่ตู้。

  Y(%)＝[(N0- N)/N0]× 100 由于N0(原始细胞数量)和N (经t时间操作后保留下来的 未损害完整细胞数量)不能很清楚的确定，因此破碎率的 评价非常困难。

  利用显微镜或电子微粒计数器可直接计数完整细胞数， 所以可用于破碎前的细胞计量。可是破碎过程中所释放 的物质如DNA和其他聚合物组分会干扰计数，此时可采 用染色法把破碎的细胞从未损害的完整细胞中区别开， 以便于计数。

  破碎率的测定：革兰氏染色法（初染1’、媒染 1’、脱色20-30’’、复染4’）、镜检计数。

  细胞培养和收集：将活化巨大芽孢杆菌种接 入肉汤液体培养基中，37℃振荡培养。当到 达对数少长期后(约18h)，用离心机收集细胞， 3500rpm离心20min。

  导电率的变化是由于细胞内含物被释放到水相中而 引起的。导电率随着破碎率的增加而呈线性增加。

  因为导电率的读数取决于微生物的种类、处理的 条件、细胞浓度、温度和悬浮液中电解质的含量，因此 应预先采用其他方法来进行标化。

  1. 酵母、巨大芽孢杆菌等。 2. 超声波破碎机、离心机、紫外分光光度计、研钵。 3. 烧杯（250ml）、塑料管（80ml）。 4. 无菌水、冰水、0.2mol/l磷酸盐缓冲液。 5. 显微镜（油镜）。 6. 载玻片、接种环、吸水纸、酒精灯及火柴。 7. 结晶紫染液、Lugol’s碘液、95％乙醇、番红染液。 8.溶菌酶

  溶菌酶： 大多数都用在细菌类 蛋白酶 甘露糖酶 糖苷酶 肽键内切酶 壳多糖酶

  利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择 适当的酶，并确定相应的次序。

  如：对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘 露糖结构，使两者溶解，再加入葡聚糖酶作用的葡聚糖层， 最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破 裂，释出胞内产物。

  破碎率的测定：革兰氏染色法（初染1’、媒 染1’、脱色20-30’’、复染4’）、镜检计数。

  细胞培养和收集：将活化的巨大芽孢杆菌种接 入肉汤液体培养基中，37℃振荡培养。当到达 对数少长期后(约18h)，用离心机收集细胞， 3500rpm离心20min。

  超声波振荡会造成温度的剧烈上升，操作时可以在 细胞悬液中投入冰或在夹套中通入冷却剂进行冷却。

  对于不同菌种，超声波处理的效果不同，杆菌比球菌 易破碎，革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌易破碎，对酵母 菌的效果差。

  ① 振幅 振幅直接与声能有关，影响蛋白质释放的比速度 k。 ② 细胞悬浮液的粘度 粘度影响能耗并会抑制空穴现象。

  酶解：称取适量酶，加入菌悬液中，使酶最终 浓度为4mg/ml，37℃条件下反应1h。

  破碎率的测定：革兰氏染色法（初染1’、媒染 1’、脱色20-30’’、复染4’）、镜检计数。

  4. 超声波在液体中起空穴作用，使液体温度会快速 升高，可采用短时间的多次破碎，同时可补加冰 浴冷却。

  1. 细胞破碎的方法有哪些？ 2. 超声波破碎细胞时应注意的问题是什么？ 3. 计算本次实验细胞破碎的破碎率。

  细胞培养和收集：将活化菌种接入肉汤液体培 养基中，37℃振荡培养。当到达对数少长期后 (约18h)，用离心机收集细胞，3500rpm离心 20min。

  1. 按样品的多少选择适当的容器（试管或各种烧杯 及离心管），固定好，调节好振动系统的位置。

  2. 变幅杆末端插入样品液面10～15mm，并使其在 容器的中心位置，不得让变幅杆与容器相接触。 变幅杆末端离容器一般应大于30mm，量小时， 功率开小情况下可大于10mm。

  3. 设定：上班时间不宜开的过长，1～10秒内选用； 间隙时间应大于上班时间。